為了對以個特定序列進行PCR做重復(fù)檢測,需要三個不同的區(qū)域,每一個區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細列出

　　1、樣品準(zhǔn)備區(qū)

　　這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采

　　取預(yù)防措施：

　　1)PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。

　　2)組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。

　　3)用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。

　　4)DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。

　　5)大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。

　　6)管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。

　　7)任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。

　　2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR

　　RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。

　　3、前PCR區(qū)

　　必須有專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

　　4、PCR實驗室試劑的操作

　　1)所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

　　2)所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。

　　3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應(yīng)。

　　4)所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。

　　5)所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

　　6)新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗。

　　7)樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。

　　5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物

　　1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。

　　2)如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

　　3)作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。